內(nèi)毒素(Endotoxin)是一種脂多糖(LPS)，來(lái)源于革蘭氏陰性細(xì)菌外膜，其細(xì)胞壁外膜的外部脂質(zhì)成分由內(nèi)毒素分子組成，細(xì)胞死亡或分解后被釋放出來(lái)。LPS具有三個(gè)結(jié)構(gòu)，由菌體特異性多糖、非特異性核心多糖和脂質(zhì)A三部分構(gòu)成。內(nèi)毒素單體分子量為10kDa左右，在不同成分水溶液中，可形成大分子聚集體，大的可超過(guò)1000 kDa。類脂A是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應(yīng)的主要基團(tuán)。該基團(tuán)沒(méi)有種屬特異性, 所以各屬細(xì)菌的類脂A 結(jié)構(gòu)相似, 其毒性反應(yīng)相似，如發(fā)熱、血液流動(dòng)力學(xué)改變、彌漫性血管內(nèi)凝血, 并導(dǎo)致休克等。O-特異多糖位于菌體胞壁的最外層，由若干重復(fù)的寡糖單位組成。多糖的種類與含量決定著細(xì)菌種、型的特異性，以及不同細(xì)菌間具有的共同抗原性。它還參與細(xì)菌的抗補(bǔ)體溶解作用。

內(nèi)毒素不是蛋白質(zhì), 熱穩(wěn)定性強(qiáng)。在 100℃的高溫下加熱1h 也不會(huì)被破壞, 115℃30m in 濕熱僅能破壞 25% 左右的熱原質(zhì)。只有 180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h 干烤, 或用強(qiáng)堿、強(qiáng)酸或強(qiáng)氧化劑加溫煮沸 30min才能破壞它的生物活性。

內(nèi)毒素帶有負(fù)電荷, 由于脂多糖結(jié)構(gòu)中類脂 A 的疏水性, 使得內(nèi)毒素傾向于以高分子聚合物的狀態(tài)存在而難溶于水, 并由于環(huán)境中 Ca2+、Mg2+等被吸引到帶負(fù)電荷的脂多糖上而得以穩(wěn)定。通常其分子量幾十萬(wàn)至上千萬(wàn)道爾頓。

內(nèi)毒素的產(chǎn)生：

基因工程蛋白通常采用細(xì)菌、酵母、哺乳動(dòng)物細(xì)胞或昆蟲(chóng)細(xì)胞作為宿主進(jìn)行大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn), 但大多是以大腸菌作為表達(dá)系統(tǒng)。以大腸桿菌作為表達(dá)系統(tǒng)的蛋白通常都是在胞內(nèi)表達(dá), 在純化蛋白之前必須通過(guò)高壓勻漿、超聲波破碎或低壓滲透等方法將菌種破壁, 以釋放蛋白。同時(shí)細(xì)胞壁內(nèi)的脂多糖也大量釋放到緩沖液中, 通常 10% 的濕菌濃度可產(chǎn)生幾萬(wàn)EU/mL 的內(nèi)毒素, 這是內(nèi)毒素的主要來(lái)源。

對(duì)于酵母表達(dá)系統(tǒng)或 CHO (中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞系) 系統(tǒng)等, 雖然表達(dá)系統(tǒng)本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素, 但在生產(chǎn)過(guò)程中因原輔材料, 生產(chǎn)環(huán)境以及個(gè)人操作等因素造成產(chǎn)品內(nèi)毒素污染, 這是產(chǎn)生內(nèi)毒素的另一來(lái)源。

在生產(chǎn)過(guò)程中如何防止內(nèi)毒素污染：

①粗純中防止內(nèi)毒素污染 無(wú)論是酵母菌、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)還是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng), 在生產(chǎn)過(guò)程中以各種途徑利用各種方法有效地防止內(nèi)毒素污染均是非常重要的。前者本身不產(chǎn)生內(nèi)毒素, 只要在生產(chǎn)過(guò)程中能有效防止內(nèi)毒素的污染, 就可以得到熱原合格的產(chǎn)品; 后者雖然不可避免地產(chǎn)生內(nèi)毒素, 但通常在初步純化中已采取有效措施, 可以大量減少內(nèi)毒素含量。

②通過(guò)無(wú)菌操作和控制操作區(qū)潔凈度來(lái)防止外源性內(nèi)毒素污染。首先, 生產(chǎn)車間必須是符合 GMP要求的潔凈廠房, 各種不同的操作在不同的潔凈區(qū)內(nèi)進(jìn)行, 例如發(fā)酵和粗純應(yīng)該在十萬(wàn)級(jí)區(qū)進(jìn)行, 精純?cè)谌f(wàn)級(jí)區(qū)域內(nèi)進(jìn)行, 制劑、分裝須在百級(jí)間或?qū)恿髡窒逻M(jìn)行操作。對(duì)于任何非封閉系統(tǒng)的操作, 均應(yīng)采取無(wú)菌操作方式, 如果系統(tǒng)自動(dòng)化程度較高, 可遙控操作或較少手工操作。

③對(duì)于任何直接接觸制品的溶液、容器、生產(chǎn)用具、管路、生產(chǎn)系統(tǒng)等必須進(jìn)行嚴(yán)格有效的處理, 去除熱原。用蒸餾法或反滲法制備的新鮮注射用水或滅菌注射用水通常都是無(wú)熱原的, 這是清洗器具及配制溶液的基礎(chǔ)。生產(chǎn)器具一類是玻璃器皿, 不銹鋼制品, 這些器具可置180℃ 3～ 4h 或 250℃ 1～ 2h干烤, 除去熱原。另一類為橡膠、塑料制品, 如膠塞、膠管等, 可采用 0.1M鹽酸煮沸30min, 或 0.1M氫氧化鈉浸泡 4h以上, 急用時(shí)可煮沸30min, 然后用新鮮注射用水沖洗凈, 再高壓滅菌。對(duì)于生物制藥的某些關(guān)鍵步驟可采用無(wú)菌、無(wú)熱原的一次性器具, 既可以減輕勞動(dòng)量, 又可以防止清洗不凈帶來(lái)的污染。溶液配制要使用無(wú)熱原的新鮮注射用水, 整個(gè)過(guò)程必須于 3h 內(nèi)完成, 并及時(shí)高壓滅菌。對(duì)于一些不能滅菌的溶液, 可通過(guò)超濾法除熱原。如(PBS) 在高壓滅菌時(shí)會(huì)產(chǎn)生具有紫外吸收的焦磷酸, 在使用磷酸鹽液緩液(PBS) 進(jìn)行柱層析時(shí), 就對(duì)層析圖譜產(chǎn)生干擾, 在干擾素的生產(chǎn)與檢定中曾經(jīng)出現(xiàn)過(guò)這樣的問(wèn)題, 采用截留相對(duì)分子質(zhì)量 (NMWL ) 為 10kDa的超濾膜超濾可有效去除溶液中的熱原。

生物技術(shù)藥品的生產(chǎn)中, 對(duì)于系統(tǒng)、管路的清洗涉及在位清洗(CIP)/在位滅菌(SIP)的概念主要是針對(duì)泵、管道、閥門、濾器、柱、各種罐等需定期清洗滅菌的設(shè)備,常規(guī)要求在不拆任何組件的情況下原位進(jìn)行。例如層析系統(tǒng),它是生物技術(shù)藥品生產(chǎn)中廣泛使用的單元操作,在清洗/在位滅菌十分重要,有效的在位清可以減少產(chǎn)品污染的危險(xiǎn)性、維持柱效和提高介質(zhì)壽命。氫氧化鈉被經(jīng)常用作在位清洗時(shí)的清洗液。

細(xì)菌內(nèi)毒素的檢測(cè)：

細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法系利用鱟試劑來(lái)檢測(cè)或量化由革蘭陰性菌產(chǎn)生的細(xì)菌內(nèi)毒素, 以判斷供試品中細(xì)菌內(nèi)毒素的含量是否符合規(guī)定的一種方法。鱟試劑法的反應(yīng)機(jī)理是細(xì)菌內(nèi)毒素在二價(jià)陽(yáng)離子參與下激活鱟血細(xì)胞溶解物中的一系列凝聚酶的反應(yīng)。其包括兩種方法，即凝膠法和光度測(cè)定法，后者包括濁度法和顯色基質(zhì) 法。檢測(cè)時(shí)可用其中任一種方法，當(dāng)結(jié)果有爭(zhēng)議時(shí)，另有規(guī)定外，以凝膠法結(jié)果為準(zhǔn)。鱟試劑法具有簡(jiǎn)便、迅速、定量準(zhǔn)確、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)，在國(guó)際上受到廣泛應(yīng)用，已被美國(guó)、歐洲、日本等國(guó)《藥典》及《生 物制品規(guī)程》收載，我國(guó)2005年版藥典也已收載，應(yīng)用于藥品、生物制品的熱原檢定。

細(xì)菌內(nèi)毒素的去除：

由于內(nèi)毒素顯著的危害性，F(xiàn)DA等法規(guī)也對(duì)內(nèi)毒素的控制和將其降低到安全水平提出明確要求。無(wú)菌操作和操作區(qū)潔凈度也是控制外源性內(nèi)毒素污染的有效手段。然而對(duì)于樣品本身就存在的內(nèi)源性內(nèi)毒素污染，即使外源性內(nèi)毒素得到有效控制，最終工藝制備的樣品也存在內(nèi)毒素超標(biāo)的風(fēng)險(xiǎn)。那么就需要從樣品本身制備工藝角度，結(jié)合內(nèi)毒素特點(diǎn)，尋找有效方法，使樣品本身內(nèi)毒素(Endotoxin)降低，達(dá)到工藝要求，提高產(chǎn)品安全性。
①疏水層洗法：一般來(lái)說(shuō)內(nèi)毒素的疏水性都是遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于目標(biāo)物的，因此在疏水層析上樣需要高鹽緩沖液平衡，內(nèi)毒素在高鹽下發(fā)生凝集，不結(jié)合疏水介質(zhì)，因而上樣時(shí)直接穿透而被去除。或者采取目標(biāo)樣品流穿模式，在一定鹽濃度下使目的蛋白不結(jié)合填料，而內(nèi)毒素分子可與填料結(jié)合，使兩者實(shí)現(xiàn)分離。

②離子交換法：對(duì)于陰離子交換層析，內(nèi)毒素在 pH>2時(shí)帶負(fù)電荷，與陰離子交換介質(zhì)Q或DEAE有較強(qiáng)結(jié)合, 可使用目標(biāo)蛋白從陰離子交換填料流穿的方式去除內(nèi)毒素；也可在目標(biāo)蛋白和內(nèi)毒素同時(shí)結(jié)合于層析介質(zhì)上后，由于內(nèi)毒素的結(jié)合能力較蛋白的結(jié)合能力強(qiáng)，因此可先將目標(biāo)蛋白洗脫出來(lái)，然后再用高鹽緩沖液或NaOH將內(nèi)毒素洗出。對(duì)于陽(yáng)離子交換層析，在pH4.0時(shí)，內(nèi)毒素還是帶有負(fù)電荷不能和填料結(jié)合而隨流動(dòng)相流出層析柱，目標(biāo)蛋白則可以與陽(yáng)離子交換介質(zhì)結(jié)合，因此采用陽(yáng)離子交換層析也可以很好的去除內(nèi)毒素。此外，采用一些表面活性劑比如Triton X-114，既能阻止內(nèi)毒素結(jié)合在陰離子柱上也可阻止內(nèi)毒素結(jié)合在陽(yáng)離子柱上。

③凝膠過(guò)濾層析：內(nèi)毒素可在水溶液中以非極性和離子相互作用，形成大小為 1,000 kDa 分子聚集體，它與多數(shù)生物蛋白分子量差異較大，基于這一特征，可以采用凝膠過(guò)濾層析，將大分子內(nèi)毒素分子與目標(biāo)蛋白分離。但其處理量小, 處理時(shí)間較長(zhǎng)。

④TFF切向流技術(shù)去除內(nèi)毒素：內(nèi)毒素在不同的水溶液中，常形成聚集體結(jié)構(gòu)，因其聚集的程度不同，分子大小不一。小聚集體分子量為10~20 kDa，而大聚集體的分子量可達(dá)1000 kDa。使用切向流膜孔徑小于內(nèi)毒素的分子量而使內(nèi)毒素分子截留，目標(biāo)樣品透過(guò)膜孔，達(dá)到去除樣品中內(nèi)毒素的目的。影響蛋白溶液中內(nèi)毒素去除因素主要包括，目標(biāo)分子的大小分布、內(nèi)毒素與目標(biāo)分子的相互作用、目標(biāo)蛋白質(zhì)濃度以及是否添加相應(yīng)的洗滌劑。

⑤通過(guò)親合層析去除內(nèi)毒素:  親合層析技術(shù), 特別是免疫吸附劑在生產(chǎn)中的運(yùn)用使得生物大分子的純化變得簡(jiǎn)單。免疫吸附的原理基于抗原、抗體的特異性作用, 以目標(biāo)蛋白作為抗原, 將通過(guò)雜交瘤技術(shù)生產(chǎn)的單克隆抗體偶聯(lián)于介質(zhì)上, 以此介質(zhì)來(lái)吸附目標(biāo)蛋白。由于相互作用的高度特異性, 理論上僅有目標(biāo)蛋白吸附于介質(zhì)上, 內(nèi)毒素全部穿透, 洗脫后將得到純度很高的無(wú)熱原產(chǎn)品。實(shí)際上, 由于介質(zhì)本身存在的非特異性吸附, 仍有少量的雜蛋白和內(nèi)毒素同時(shí)被吸附, 但內(nèi)毒素含量是極低的。在干擾素(IFN)生產(chǎn)中, 洗脫物內(nèi)毒素含量一般為0.25EU/mL。

⑥利用特異性吸附內(nèi)毒素介質(zhì)去除內(nèi)毒素：將內(nèi)毒素底物L(fēng)AL或多粘菌素B(PMB)偶聯(lián)于層析介質(zhì)上, 以此介質(zhì)特異性吸附內(nèi)毒素, 而蛋白不會(huì)被該層析介質(zhì)吸附隨流動(dòng)相流出，收集該流出蛋白即可。該方法去除內(nèi)毒素效果較好, 但有一定的蛋白損失。

總的來(lái)說(shuō)，目前還沒(méi)有適用于生物制藥工藝中去除內(nèi)毒素的通用方案。尤其內(nèi)毒素含量特別高的樣品，單一方式去除效果不好時(shí)，需要結(jié)合不同生物制品和不同工藝的特點(diǎn)，考慮多種方式組合以降低工藝過(guò)程的內(nèi)毒素雜質(zhì)，提高產(chǎn)品安全性，從而滿足相關(guān)法規(guī)要求。

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